免疫組化實驗需注意樣本處理、抗體選擇、實驗條件優化、對照設置、結果判讀等關鍵環節，確保實驗結果的準確性和可靠性。
1. 樣本處理：組織樣本需在離體後盡快固定如4%中性甲醛，固定時間控制在24-48小時，避免過度固定導致抗原丟失或自溶。切片厚度一般為3-5μm，防止過厚影響染色滲透性，脫水包埋過程需規範操作。
2. 抗體選擇：優先選用已驗證特異性的一抗，注意抗體種屬來源與二抗匹配，根據組織類型和靶蛋白表達水平調整稀釋比例。需確認抗體保存條件及有效期，避免反復凍融導致效價下降。
3. 實驗條件優化：抗原修復需根據抗體要求選擇熱修復如EDTA緩衝液或酶消化法，嚴格控制修復溫度和時間。封閉步驟使用5%BSA或正常血清，阻斷非特異性結合，孵育時間建議30-60分鐘。
4. 對照設置：每批次實驗需包含陽性對照已知表達靶蛋白的組織和陰性對照省略一抗或使用同型IgG，內參抗體如β-actin幫助評估樣本質量。多重染色時需設置交叉反應對照。
5. 結果判讀：需結合陽性信號定位細胞核/質/膜與組織形態學特徵，排除邊緣效應、乾燥偽影等因素干擾。弱表達樣本建議採用放大系統增強顯色，定量分析需統一成像參數。
免疫組化技術的應用需結合嚴謹的操作規範和臨床實際需求。實驗人員應定期校准設備並記錄環境溫濕度，避免交叉污染。對於疑難病例或異常結果，建議重復實驗並與病理醫師共同分析，必要時聯合其他檢測方法驗證。患者送檢前應告知完整病史及用藥信息，若需多次取材應評估組織剩餘量，術後樣本需按生物安全標準處置。遇到染色失敗時，建議系統排查從固定到顯色的每個步驟，而非僅更換單一試劑。
