支原體培養的關鍵注意事項包括樣本採集與處理、培養基選擇與配制、培養環境控制、污染防控措施等。
1. 樣本採集與處理：需嚴格執行無菌操作，選擇感染部位分泌物或組織標本，使用專用轉運培養基並在2小時內送檢，避免冷凍或高溫暴露造成病原體死亡。呼吸道樣本應避開正常菌群富集區域，泌尿生殖道樣本需區分靜置尿與拭子取材的適用範圍。
2. 培養基選擇與配制：推薦使用SP4培養基或改良的PPLO培養基，需添加20%滅活胎牛血清、10%酵母浸膏及0.002%酚紅指示劑。每批次培養基應做促生長試驗驗證，pH值嚴格控制在7.6-7.8之間，分裝時保留適當氣相空間。
3. 培養環境控制：採用三氣培養箱維持5%二氧化碳濃度，溫度恆定在35-37℃，相對濕度>80%。平板培養需雙層密封防止脫水，液體培養基每周盲傳三代，持續觀察4周以上。定期校准培養箱氣體濃度探頭，避免頻繁開閉培養箱導致環境波動。
4. 污染防控措施：操作全程在生物安全櫃中進行，對青霉素耐藥株可添加2-4μg/ml環丙沙星。每周用支原體PCR檢測試劑盒監測細胞污染，發現污染立即隔離處理。培養基高壓滅菌後需檢測支原體滅活效果，建議使用0.1μm孔徑濾膜二次除菌。
臨床實踐中應根據不同菌種調整培養方案，如肺炎支原體需要延長培養週期至21天，生殖支原體需額外添加精氨酸。實驗室應建立標準操作流程並定期進行人員培訓，培養結果需結合血清學檢測綜合判斷。對於免疫功能低下患者，即使培養陰性也不能完全排除感染可能，建議多次採樣或採用分子生物學方法輔助診斷。醫療廢物處理須符合生物安全二級標準，所有接觸樣本的耗材應高壓滅菌後按醫療垃圾處置。
